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    软骨细胞通过转录因子FoxO1促进骨折愈合中血管的医学形成分析

    类别:范文 发布时间:2020-09-04 10:50 浏览:

    本文是一篇医学论文,本研究探讨了软骨细胞在骨折愈合过程中对血管化的影响以及在这一过程中转录因子 FoxO1 发挥的作用。实验首先利用软骨细胞内 FoxO1 基因敲除小鼠骨折模型,采用 Micro CT,Western blot 及免疫荧光法(Immunofluorescence, IF)验证了模型的成功建立并探讨软骨细胞内 FoxO1 敲除对小鼠骨折愈合的影响。随后采用 qRT-PCR 和 IF 检测血管化标志物 CD31 及血管长因子(VEGFA)的表达变化,阐述 FoxO1 基因对软骨血管的影响。最后,在体外实验中通过利用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)技术及双荧光素酶报告实验(Luciferase Reporter Assay),探讨软骨细胞内转录因子 FoxO1 对骨折愈合过程中血管化的调控机制。第 1 章 文献综述1.1 骨折综述1.1.1 骨折愈合的过程骨折愈合和骨骼组织修复涉及初始合成代谢阶段,这一阶段的特征是由形成骨骼和血管组织的干细胞的重新募集与分化导致的组织体积增加。软骨愈伤组织于紧邻骨折线的部位形成。在其外围,即新软骨组织的边缘,骨膜膨胀并开始形成初级骨化中心[1]。随着软骨组织的发育,即将形血管并供应新骨形成的细胞被募集并在周围的肌鞘中分化[2, 3]。环绕并长入到愈伤组织中的血管床逐渐增加,使进入组织修复区域的血流量增加。随着软骨细胞分化的进展,软骨细胞外基质逐矿化,随后软骨细胞凋亡提示骨折修复的合成代谢阶段终止[4, 5]。合成代谢阶段之后是分解代谢活动占据主导地位的的延长阶段,其特征在于愈伤组织体积的减少。在分解代谢阶段仍然有合成代谢过程的参与,例如软骨吸收过程中继特定的合成代谢过程; 当软骨被吸收时次级骨化中心形成骨组织取代软骨,初级血管成。随后,当骨重塑开始时,在初级骨形成期的第一矿化基质被破骨细胞吸收,于软骨吸收期的次级骨也被吸收。随着骨痂组织继续被吸收,愈伤组织被重塑为骨的原始皮质结构。这一阶段的特征在于成骨细胞和破骨细胞活性的偶联循环。在此期间,重建骨髓空间造血组织和骨的原始骨髓结构。在分解代谢阶段的最后阶段广泛的血管重塑,增加的血管床快速退化并且返回到骨折损伤前的水平[6, 7]。尽管这些过程是连的,但它们基本上重叠并且是组织内改变细胞群和信号传导过程的连续体。图 1.1 显示了骨折愈物学事件和每个骨折愈合阶段所涉及的细胞类型的时间概述。........................1.2 血管化综述1.2.1 血管化在骨折修复过程中发挥的作用骨折愈合是一个复杂的过程,需要四种主要组织的协调反应:骨髓、皮质骨、骨膜和骨折周围未分化的筋膜。接近的骨折断端需要两个基本因素来愈合:血液供应和稳定性。如果提供刚性内固定,并且两个骨折断端贴在一起,断端之间没有微运动,初级皮质或骨愈合。这是由破骨细胞和成骨细胞直接介导的,几乎没有来自周围组织的参与[1, 45, 46]。更常见的是,骨折采用外固定、髓内固定或钢板治疗,允许骨折部微运动,通过膜内和软骨内骨形成导致二次愈合。软骨内骨形成过程模拟长骨骨骺板的形成,首成,接基质钙化、血管侵犯,最后将该血管钙化基质重塑为骨。一般来说,骨折愈合的四个时间阶段是血肿形成期、炎症反应期、软骨内骨化,最后是骨重塑[1]。在这四个时间阶段中的每一个阶段,血管化及血管长因子都发挥了至关重要的作用。血肿形成期:长骨骨折会切断贯穿皮质骨的哈弗斯管以及骨膜和髓质管的纵向血管作文,周围软组织中的血管也可能受损。机体不仅对骨折局部进行调节,同时发挥系统性调节以促进骨折愈合。Street 等人评价骨折血肿循环血浆中血管长因子水平与局部血管长因子浓度的差异证明格式范文,与健康对照组相比,骨折受试者血液循环中血管长因子水平显著升高,骨折血肿中血管长因子水平比受试者血浆高 15 倍。研究还发现,骨折断端之间的血肿起到了贮藏血管长因子的作用。在骨折血肿中观察到高浓度的血管长因子,以及血管长因子在内皮细胞增殖、内皮细胞迁移、成骨细胞迁移和成骨细胞活化中的已知作用,说明了骨折中血肿的形成是修复过程中不可分割的一部分。............................第 2 章 材料与方法2.1 试剂的配制方法2.1.1磷酸缓冲盐溶液(1×PBS)将 8.00 g 的 Na Cl,0.20 g 的 KCl,1.44 g 的 Na2HPO4 和 0.24 g 的 KH2PO4在 800 ml 的去离子水中溶解。通过利用磁力搅拌器进行充分溶解后,用 HCl调节 pH 值至 7.4 并定容至 ml。高压灭菌 30 min 后 4 ℃保存。2.1.22.5 % 胰蛋白酶(trypsin)溶液将 5.00 g 胰蛋白酶粉末,0.40g EDTA 溶解于 100ml PBS 平衡盐溶液中。加入 NaHCO3 调节 pH 值至 7.4 并添加 PBS 平衡盐溶液定容至 200 ml。溶液充分过滤后除菌,并分装于-20 ℃保存。使用时利用高压除菌后的去离子水 10 倍稀释。2.1.3免疫荧光实验相关试剂的配制(1)固定缓冲液于 PBS 100 ml 中加入 4g 多聚甲醛粉末并置于搅拌器上,70℃条件下搅拌 1 h,待溶解后置于 4℃保存。(2) 细胞通透缓冲液于 PBS 100 ml 中加入 0.5 ml Triton X-100 溶液并置于恒温水域锅中,50℃条件加热 1 h,待溶解后置于 4℃保存。(3)抗体稀释液配制含 1%浓度BSA 的 PBS 溶液,按照抗体说明书所示以 1:100 或 1:200的比例稀释抗体证明格式范文,置于 4℃或-20℃保存。(4) DAPI 试剂配制于 5 ml 的 PBS 溶液中 DAPI 0.5mg,配制成工作液体,分装于-20℃长期保存。使用时利用 PBS 对储存液进行稀释使最终工作浓度为 0.5 ug/ml。.........................2.2 实验动物分组及骨折模型的建立以 12~14 周龄软骨细胞 Col2?1Cre+.FoxO1 L/L谱系特异性 FoxO1 缺失小鼠20 只为实验组,同源 Col2?1Cre-.FoxO1L/L 小鼠 20 只为对照组。小鼠由膝盖外侧切开,将股四头肌肌腱向外侧推并暴露股骨关节面。使用 27 号针进入骨髓腔并插入 30 号针固定。切口缝合后,使用断头台装置,由钝性创伤造成可控闭合性简单横向骨折。该钝性创伤的力度可致小鼠股骨骨折却并不损害固定针,从而保证了骨折断端的固定。骨折后 16 天处死小鼠并采集股骨。股骨采集后对骨折部位进行了放射学评估。所有非中骨干骨折或严重粉碎性骨折均排除在研究范围之外。小鼠软骨样细胞 ATDC5 细胞购买于美国 ATCC 细胞库。ATDC5 细胞培养使用 50% DMEM 与 50% F12 混合培养基并加入 5% FBS 以及 1素。人微血管内皮细胞(HMVEC)购买于美国 Cell Systems 细胞库,培养于含有 5%FBS和 1素的 EGM-2V 培养基中。ATDC5 细胞培养所应用的 DMEM 培养基、F12 培养基及胎牛血清购自美国 GIBCO 公司,青霉素与链霉素购自 Invitrogen公司。..........................第 3 章 实验结果 .................................... 333.1 体内验证软骨细胞内 Fox O1 敲除对骨折愈合及成的影响 .. 333.1.1 验证条件性基因敲除小鼠骨折模型的构建 ........................ 333.1.2 骨折愈合中软骨细胞及 FoxO1 对血管化的影响 ............... 35第 4 章 讨 论 .......................... 474.1 条件性 FoxO1 敲除小鼠骨折模型的检测 ................................. 484.1.1 验证软骨细胞内 FoxO1 的敲除 ............................ 484.1.2 验证小鼠骨折模型 ...................... 48第 4 章 讨论4.1 条件性 FoxO1 敲除小鼠骨折模型的检测为研究 FoxO1 对血管形成的影响,实验设计 FoxO1 基因敲除小鼠。然而系统性敲除 FoxO1 会导致小鼠胚胎死亡证明格式范文,基于软骨细胞在骨折中发挥的重要作用,从而选择应用 Cre-loxP 重组酶技术,以 Col2?1 作为目标载体于软骨细胞内特异性敲除 FoxO1 基因。Cre-loxP 系统是目前应用最广泛的条件性基因敲除工具,主要是因为该系统具有高效性,特异性强及应用范围广的特性。有文献证实 Col2?1Cre 转基因模型可以特异性地删除软骨细胞中的固定基因,同时并不影响该基因在其他细胞中的表达[139-143]。4.1.1 验证软骨细胞内 FoxO1 的敲除骨折模型的建立通过将小鼠膝盖外侧切开,将股四头肌肌腱向外侧推并暴露股骨关节面。使用 27 号针进入骨髓腔并插入 30 号针固定。切口缝合后,使用断头台装置,由钝性创伤造成可控闭合性简单横向骨折。该钝性创伤的力度可致小鼠股骨骨折却并不损害股骨内的固定针,从而保证了骨折断端的固定,确保了软骨内骨化的骨折修复方式。应用 MicroCT 对骨折部位进行了放射学评估,所有非中骨干骨折及严重粉碎性骨折均被排除在研究范围之外,从而排除由不同类型的骨折造成的实验误差。..........................结论1.验证了 Col2⍺1Cre.FoxO1L/L 基因敲除小鼠骨折模型的成功建立;2. 软骨细胞内 FoxO1 的敲除导致了实验小鼠血管形成数量明显减少,证明了软骨细胞通过转录因子 FoxO1 促进血管的形成;3. 软骨细胞内敲除 FoxO1 使实验组小鼠 VEGFA 表达下降,阐明了实验组小鼠成数量减少的可能机制并证明了VEGFA的表达受到FoxO1的调控;4. 实验组小鼠骨痂内 VEGFA 的 mRNA 表达显著下降,证明了软骨细胞是VEGFA 的重要来源;5. 实验组小鼠骨折愈合不良,证明了软骨细胞通过 FoxO1 促进血管的形成,进而发挥促进骨折愈合的作用;6. 阐述了 FoxO1 调控 VEGFA表达的机制:转录因子 FoxO1 可以与 VEGFA启动子直接结合,上调 VEGFA 的启动子活性;7. FoxO1 调控 VEGFA 表达的能力受到翻译后修饰—乙酰化的影响;乙酰化条件下,FoxO1 失去了调控 VEGFA 的能力;去乙酰化增强了 FoxO1 对 VEGFA的调控作用。参考文献(略)
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